猪链球菌协同感染在猪相关疾病中的投机性作用(二)

猪链球菌协同感染在猪相关疾病中的投机性作用(二)

Milan R Obradovic 和 Mariela Segura等

摘要：猪链球菌是影响断奶仔猪健康的最重要的细菌性病原体之一，主要引起脑膜炎、关节炎和猝死。它不仅会给猪场造成严重的经济损失，还会引发人们对动物福利和抗生素耐药性的担忧，在一些国家仍然是一种重要的人畜共患病原体。猪链球菌相关疾病的定义和诊断可能很复杂。猪链球菌应被视为主要病原体还是次要病原体？当提及呼吸道疾病时，情况会更加复杂，因为在历史上该病原体一直被认为是猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)中的次要病原体。猪链球菌是呼吸道的病原体还是严格意义上的全身性病原体？猪链球菌是猪上呼吸道的正常居民，仅存在潜在的强毒株并不能保证出现临床症状。在这种不明背景下，人们普遍认为，与一些病毒性和细菌性病原体的协同感染会显著影响猪链球菌相关疾病的严重程度，这可能是理解感染在现场表现的关键。在本综述中，我们批判性地讨论了已报道的流行病学联系(混合感染或同时存在多种病原体)的研究，以及猪链球菌与其他病原体协同感染的体外和体内研究，讨论了它们的局限性和改进的可能性，并为未来的研究提出了建议。

关键词：猪链球菌；协同感染；混合感染；猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪流感病毒；猪圆环病毒2型；细菌混合感染和与协同感染；猪呼吸道综合征

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3  猪链球菌应被视为呼吸道或全身性病原体，或者两者兼而有之？

虽然许多研究都探讨了猪链球菌在午呼吸道疾病中的作用，但病原体的进入途径应与诱导的病理学区分开来。尽管有一个关于肠道易位的假设(仍有待证实)^[27]，但人们普遍认为，猪链球菌病的主要感染途径是呼吸道^[2]，并且已经清楚地证明了猪链球菌可以通过空气传播^[28]。在此背景下，猪链球菌是否应被视为真正的呼吸道疾病的病原体可能存在争议。引发猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)的传染源分为原发性或继发性(或机会性)病原体^[17]。原发性病原体的定义是，能够作为第一种独特病原体感染动物，然后促进继发性或机会性协同感染的病原体。猪链球菌通常被认为是继发性/机会性病原体^[17]。然而，即使是作为机会性病原体，猪链球菌在呼吸道疾病病理学中的作用仍然不清楚。基于自然感染病例的研究表明，猪链球菌可能会导致感染猪的肺脏发生病变，通常会发展成化脓性支气管肺炎和/或纤维蛋白出血性胸膜肺炎^[29-31]。然而，在大多数自然感染病例中，也能分离到其他伴发细菌，因此很难评估猪链球菌的具体作用^[32]。实验性感染猪链球菌的猪通常不会出现呼吸道临床症状，临床症状主要是败血症、脑膜炎和/或关节炎，在已经研究的空气传播病例中也观察到了这些症状^[28,33]。少数观察到呼吸道症状的病例通常伴有心脏病变(心内膜炎或心包炎)有关，但未累及肺脏(未发表的观察结果)。在某些情况下(先前对鼻黏膜的刺激)，鼻内实验性感染可能主要诱发脑膜炎和关节炎，而没有与呼吸道疾病相关的肺部病变^([33]和未发表的数据)。对高度易感的剖腹产缺乏初乳仔猪的鼻内感染也会引发全身性疾病^[34]。最近，对常规猪的协同感染研究(见下文)显示，猪感染链球菌后会出现一些肺部病变，不过这些研究没有讨论是否存在其他机会性细菌病原体^[20]。事实上，在评估猪链球菌分离株的潜在毒力(病理类型)时，从肺部分离到的分离株要么不包括在研究中，要么通常被认为可能是机会性细菌^[10,35]。猪链球菌也可能在死后入侵肺脏，这也是不允许使用从肺部回收的分离株来生产自体疫苗的原因之一^[26]。

最后，从有呼吸症状和肺部病变的幼龄猪肺脏回收的猪链球菌，应与屠宰时从宰杀猪肺部回收的猪链球菌区分开来。由于老年猪体内存在高水平的抗体，猪链球菌很少会导致育成猪发病^[25]，因此不应考虑在屠宰时从这类混合感染病例中检测病原体。事实上，猪链球菌可能从健康肺部分离出来，但没有病变，这可能是因为一些携带者可能会在痛苦时从上呼吸道转移到下呼吸道^[2,36]。

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4 猪链球菌和病毒混合和/或协同感染

猪链球菌与猪源性病毒混合感染是猪群中的常见病。据认为，这些相互作用会产生协同效应，导致临床症状加重和死亡率上升。然而，很少有人对真正的协同感染(co-infection)进行对照研究。与猪链球菌病相关的最重要的病毒性病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其次是猪流感病毒(SIV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)。考虑到对其他病毒的协同感染研究很少，为了更好地了解猪链球菌与猪源性病毒协同感染的重要性，我们将讨论已报道的混合感染的主要发现，以及可能有助于阐明相互作用的受控体外和体内试验。表1和表2总结了猪链球菌和病毒体外和体内实验研究的重要细节和条件。

4.1 猪链球菌和PRRSV混合和协同感染

30多年来，PRRS一直是猪的主要病毒性疾病之一，给养猪业造成了重大经济损失，仅在美国每年就造成超过6亿多美元的损失^[37]。表现出的临床症状从妊娠母猪的繁殖障碍到断奶仔猪和生长猪的严重呼吸道疾病不等。PRRSV具有相当大的遗传变异性(约60％)，可分为欧洲型PRRSV (基因1型)和北美型PRRSV(基因2型)^[38]；可以单独引发严重疾病，也可以与其他病毒或细菌协同作用，对PRDC产生重大作用^[40-42]。有报道称，PRRSV可感染猪的肺间质、肺泡和血管内的巨噬细胞，从而降低巨噬细胞的吞噬活性，改变呼吸道的先天性免疫反应，为其他机会性病毒和细菌等病原体的入侵敞开大门^[43]。然而，关于病毒感染的特定细胞类型，目前仍存在一些差白^[37]。

4.1.1 PRRSV-猪链球菌混合感染

从临床角度来看，强有力的非书面证据表明PRRSV和猪链球菌之间存在明显的协作作用，大多数养猪生产者坚信，阳性不稳定(I类)猪群^[44]比PRRSV稳定或无PRRSV的猪群更容易发生严重的猪链球菌病。文献中的一些病例描述了在同一猪场同时检测两种病原体(混合感染)。尽管PRRSV血清流行率是猪群感染病毒的良好指标，但需要通过RT-PCR分析来检测有效成分，并确认PRRSV与其他猪源性病原体的混合感染^[45]。例如，对韩国猪场的猪口腔液进行的RT-PCR分析表明，在3～7周龄的仔猪中，经常能同时检测到PRRSV和猪链球菌(约50％)^[46]。对加拿大屠宰场中猪群的研究表明，对猪扁桃体中的猪源性病原体进行RT-PCR分析后，分别在53.7％和22％的样本中检测到猪链球菌和PRRSV^[13]。同样，另一项对屠宰猪的研究表明，对PRRSV RT-PCR阳性猪的肺进行检测，猪链球菌的阳性率明显更高^[47]。这些数据(来自屠宰场和非临床样本)并没有揭示病原体之间相互作用的性质，以及由于PRRSV的地方流行性特征和猪链球菌的普遍存在而可能产生的协同作用。事实上，重要的是要指出，这两种病原体都可能存在于没有任何相关临床症状的猪群中。

在越南，Hoa等^[48]发现，从流行PRRSV猪场的患病猪血液和内脏组织中分离到的高致病性猪链球菌2型的比例(18％)高于未感染PRRSV猪场的猪的(2％)。有趣的是，该国观察到，由猪链球菌引起的人脑膜炎的发病率与猪场暴发PRRSV存在时空关联^[49]。应该指出的是，这研究调查的是关联性，而不是因果关系。该研究也有局限性，研究人员已经明确指出：没有完整的PRRSV暴发细节，样本收集存在差异，低估了PRRSV暴发的实际流行率和分布情况，以及缺乏可能构成混淆因素的发病猪个体数据的详情。

世界各地为数不多的流行病学研究和从业人员的临床观察表明，猪链球菌-PRRSV的关联对猪暴发严重疾病非常重要。然而，仍有待解释这两种病原体协同作用背后的机制。为了更好地理解这种协同作用背后的细胞学、免疫学和分子学上的意义，相关研究人员已经开发了一些体外和体内模型。

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4.1.2 猪链球菌与PRRSV相互作用的体外研究

鉴于PRRSV的特性，对猪链球菌协同感染的研究主要探讨与先天性免疫系统细胞的相互作用。虽然尚未完全弄清楚猪链球菌感染的发病机制^[7]，但据认为，猪链球菌与猪呼吸道吞噬细胞的相互作用可能是感染的初始步骤之一^[16]。在这第一道防线中，猪肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophages，PAMs)通过吞噬和消灭细菌，在针对病原体的先天性免疫反应中起着至关重要的作用^[42]。

由于这些细胞也是PRRSV最重要的靶标之一，它们可能是研究协同感染效应的有趣模型^[43]。猪肺泡巨噬细胞(PAMs)用于协同感染研究背后的假设是，先前的PRRSV感染会通过降低吞噬细胞活性或诱导细胞凋亡，来减少针对猪链球菌的吞噬作用。然而，在正常情况下，猪链球菌具有厚厚的荚膜，通常可以阻止吞噬细胞对细菌的吞噬——这一事实已被使用猪链球菌的无荚膜突变体的不同研究小组证实^[7]。值得注意的是，内化(internalized)的细菌不能在细胞内存活^[50]。因此，也可以假设，尽管猪链球菌的内化是一种罕见的现象，但之前的病毒感染可能会影响细菌的细胞内杀死，从而导致细菌的死亡。猪链球菌与吞噬细胞相互作用的另一个重要方面是诱导炎症的能力。事实上，研究表明，过度的炎症是猪链球菌病的一个特征^[7]。

因此，两种病原体共同作用会通过增加促炎细胞因子的分泌，从而增强炎症反应。尽管如此，在一些PRRSV感染研究中已经证明了免疫抑制，因此可能会导致感染猪提高细菌协同感染的易感性^[51,52]。有趣的是，这两个过程并不一定矛盾，因为Renukaradhya等证明，在猪的PRRSV和猪呼吸道冠状病毒协同感染研究观察到了PRRSV的双重活性(免疫抑制但炎症增加)^[53]。多项研究探讨了猪链球菌和猪肺泡巨噬细胞(PAM)之间的相互作用^[50,54,55]，但只有一项研究报告了这些细胞先前感染PRRSV后如何影响猪链球菌的吞噬作用和炎症反应(表1)^[20]。感染高致病性PRRSV基因型2毒株和特征不明显的猪链球菌2型菌株后，PAMs增加了细菌吞噬作用和存活率^[20]。此外，协同感染显著增加了大多数被测定促炎细胞因子的mRNA表达，包括白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、趋化因子(C-C基序)配体4[chemokine (C–C motif) ligand 4，CCL4]、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素-β(interferon-β，INF-β)。研究人员得出的结论是，协同感染的有害影响主要是由于过度炎症^[20]。令人惊讶的是，没有其他研究指出协同感染对这些细胞的影响。

另一项研究探讨了使用单核细胞和猪骨髓树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)进行协同感染的效果^[56]。这两种细胞首先感染PRRSV基因2型毒株，然后与2型猪链球菌欧洲(ST1) P1/7强毒株(大多数实验室用于毒力研究)协同感染^[56]。与之前对猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的研究不同，结果表明，PRRSV显著降低了BMDC对猪链球菌的内化作用，但对细菌地细胞内的存活没有影响^[20]。对单核细胞的研究没有观察到差异，单核细胞几乎不允许病毒复制，对猪链球菌的吞噬能力也较差^[56]。如猪肺泡巨噬细胞(PAMs)所示，微阵列分析显示，在协同感染中猪骨髓树突状细胞(PAMs)的促炎基因表达显著上调^[56]。之前的猪链球菌研究表明，单独的猪链球菌能诱导动物机体分泌参与疾病发病机制的促炎细胞因子^[57]。与PRRSV的协同感染可能会通过增加免疫细胞分泌细胞因子来加剧炎症，不过这一假设应在体内试验中并没得到证实。不幸的是，目前还没有其他关于这两种重要病原体与吞噬细胞协同感染的研究。事实上，有研究表明，肺血管内巨噬细胞可能在PRRSV感染中发挥重要作用^[58]。虽然有人假设这些细胞的功能受病毒抑制与对猪链球菌继发感染的易感性增加之间可能存在关联，但还没有研究专门探讨这种相互作用。然而，PRRSV的一个有趣特征是，它可能会影响胸腺及其执行正常功能的能力^[52,59]。这样，猪就会降低抵抗和/或消除继发感染的能力。还有报道称，猪链球菌感染可会导致猪胸腺萎缩，并诱导胸腺细胞凋亡，从而可能会抑制宿主的免疫力^[60]。这两种病原体如何与这一重要的免疫器官相互作用尚不清楚。

最后，尚未在非免疫细胞上进行协同感染的研究。由于PRRSV可诱发感染猪发生非化脓性鼻炎和鼻甲上皮变性，因此有人认为它可能会使猪链球菌2型更容易在猪呼吸道上定植，从而可能会为猪链球菌创造一个侵入口^[61]。然而，病毒易导致细菌定植的假说从未得到证实。

总之，尽管人们普遍认为PRRSV感染会增加猪链球菌协同感染的易感性(见下文体内研究结果)，但似乎很明显，严重缺乏科学证据来明确解释这种相互作用的具体机制，因此需要更多的机制研究。

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4.1.3 猪链球菌与PRRSV相互作用的体内研究

尽管第一份报告未能证明PRRSV感染对猪链球菌继发感染有任何影响^[62]，但进一步的体内实验证明，这些病原体对猪的发病率和临床症状严重程度有协同作用^{[20,52,61,63,64]}。最常见的协同感染模型是通过用PRRSV经鼻感染猪，然后在5～7 d后经鼻或肌内注射猪链球菌(重要研究参数的概述见表2)^{[20,61,63,65]}。只有一项研究涉及PRRSV宫内感染(母猪)，随后仔猪感染猪链球菌^[52](见下文)。对不同的PRRSV类型(弱毒或强毒)和来源(北美或亚洲)，以及猪链球菌2型(有时特征不清)菌株进行了检测。只有一项研究使用了猪链球菌7型^[65]。这些研究的共识是，与仅感染猪链球菌的仔猪相比，同时感染这两种病原体的仔猪具有更高的死亡率和发病率，且这与病毒基因型和猪链球菌血清型无关^[20,61,65]。与单一感染猪链球菌的仔猪相比，从协同感染的仔猪组织和血液中分离并培养出的猪链球菌数量更多(菌血症)，协同感染组仔猪不同内脏器官的大体病变和微观病变明显加重^[20,61,65]。特别是，协同感染仔猪的大体和微观间质性肺炎病变明显更严重，这表明猪链球菌在PRDC中可能起次要作用^[20,42,65]。中国非典型PRRSV引起的高热疫情相似，这种协同感染能再现类似的发病率和死亡率与^[39]。有趣的是，与单一感染的对照组仔猪相比，在感染猪链球菌前给仔猪鼻内注射PRRSV疫苗株，会导致死亡率提高，不过死亡率低于与PRRSV强毒株协同感染的病例^[61]。必须指出的是，这是PRRSV减毒活疫苗的标签外使用(off-label use)，在野外条件下不太可能经鼻接种疫苗。

PRRSV是一种能够引发复杂疾病的病原体，会侵袭多个器官。妊娠母猪感染PRRSV后，在妊娠后期会出现流产、早期分娩和死产^[66]。由感染PRRSV的母猪所产的仔猪呈PRRSV阳性的，理论上它们的免疫系统会削弱，更容易感染其他机会性病原体^[66]。Feng等^[52]开发了一种动物模型，以检查仔猪宫内感染PRRSV对进一步鼻内感染猪链球菌2型的易感性的影响。据这些研究人员所知，这是唯一发表的一项关于成年猪感染PRRSV后猪链球菌协同感染的研究。妊娠母猪在妊娠98 d时接种或不接种PRRSV(见表2)^[52]。用猪链球菌2型菌株对这些母猪产下的仔猪在5日龄时进行鼻内攻毒^[52]。与未感染猪链球菌的阴性对照组仔猪和仅感染猪链球菌的阳性对照组仔猪相比，协同感染的试验组仔猪明显具有更高的死亡率，更严重的临床症状、器官病变，以及从关节和大脑中分离出来的猪链球菌数更多^[52]。据解释，易感性的增加与PRRSV对猪先天性免疫细胞的影响所导致的免疫抑制有关。事实上，PRRSV阳性仔猪的胸腺和骨髓会发生病变，包括淋巴细胞和单核细胞在内的白细胞数量显著减少^[52]。总之，该研究表明，宫内感染PRRSV会显著影响仔猪的免疫应答反应，并可能会增加它们对猪链球菌2型鼻内感染的易感性。即便如此，必须考虑存在的混杂因素，特别是所使用的实验模型。仔猪被剥夺了母猪的初乳，早期断奶，并在出生后5 d内受到细菌的攻击，这在野外很少见的，因为在野外大多数仔猪在断奶后都会受到猪链球菌的影响^[25,52]。

其他多项研究探讨了猪链球菌感染前期与随后感染PRRSV之间的关系。其中一项研究使用了6周龄的PRRSV阴性仔猪，这些仔猪在1周龄前断奶，并且体内无病原体。用含猪链球菌和另外两种病原体的细菌混合物对它们进行鼻内攻毒，以模拟现场观察到的亚临床细菌感染。1周后，仔猪受到来源不同和毒力各异的PRRSV攻击^[64]。结果显示，总死亡率较低，不过用PRRSV亚洲型强毒株攻毒的仔猪具有更为严重的发病率和病变^[64]。继发性细菌性肺炎的发病率与所评估的PRRSV毒株引起的临床严重程度直接相关。仔猪单一感染或协同感染，其促炎细胞因子水平较低或处于相同水平，这与之前的体外协同感染的研究结果相矛盾^[20，56]。另一项研究使用了3周龄的常规仔猪，内注射了猪链球菌2型菌株，7 d后接种了高致病性PRRSV MLV样分离株^[67]。结果显示，虽然病毒或猪链球菌感染会引起过渡性发热和中等严重程度的临床症状，但协同感染会引起高热、厌食和呼吸窘迫，导致60％的仔猪死亡^[67]。需要注意的是，动物感染猪链球菌的途径并不能反映自然条件，应谨慎解释研究结果。

PRRSV和猪链球菌在动物体内的协同作用是不可否认的，实验感染研究也普遍证实了这一事实。然而，以往的协同感染研究在确定机制方面仍存在许多变数。PRRSV毒株的致病性只是谜题的一部分，而其他因素如应激、环境、宿主易感性和细菌负荷等都可能会影响临床和病理结果。还有一点很重要，即所使用的猪链球菌2型菌株：在许多研究中，菌株的特征并不明显，不过众所周知猪链球菌2型毒株的毒力变化很大^[7]。一项研究表明，使用一种猪链球菌菌株(北美表型)进行协同感染不会产生影响，而使用另一种不同的菌株(欧亚表型)时则会产生很强的协同作用^[2,63]。值得注意的是，加拿大和美国经常报告PRRSV和典型的北美2型(ST28或ST25)猪链球菌的协同感染。尽管这些猪链球菌菌株的毒力可能低于欧亚型猪链球菌的^[7]，但其他因素的综合作用可能会影响协同感染的效果(图1)。有趣的是，除了上述研究外，还没有用典型的北美型猪链球菌菌株进行过协同感染试验。

(未完待续)

前文回顾：

猪链球菌协同感染在猪相关疾病中的投机性作用(一)