非洲猪瘟疫苗的最新进展

张红亮，赵赛赛等

摘要：非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever，ASFV)引起的猪的一种致命传染病。目前，该疾病被列为必须向世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，WOAH)报告的法定通知疾病。自猪瘟暴发以来，全球养猪业遭受的经济损失难以弥补。在当前的疫情期间，控制和根除ASF至关重要。接种疫苗是预防和控制ASF流行的最佳策略，但由于ASF灭活疫苗产生的免疫保护作用较差，并且没有足够的细胞系进行有效的体外ASFV复制，仍有待开发具有高免疫保护潜力的ASF疫苗。了解疾病演变过程、病毒传播方式和疫苗设计突破点，将有助于ASF疫苗的开发。本文旨在重点介绍近年来在ASF的流行和传播、病毒突变以及疫苗开发方面的最新进展和突破，并重点关注未来的方向和趋势。

关键词：非洲猪瘟病毒；流行与传播；疫苗；进展，综述

5  ASF疫苗的研究进展

5.1  ASF灭活疫苗

ASF灭活疫苗最早开发于20世纪60年代。病毒灭活包括物理和化学方法，如加热、甲苯、甲醛和结晶紫；评估疫苗效力，添加佐剂(Gómez-Puertas等，1997；Blome等，2014)。

Walczak等(2022)通过使用从ASF疫情中存活的猪上采集的血清，分析对ASFV的中和作用，结果发现仅仅采用抗ASFV的抗体不能抑制病毒的复制。然而，Blome等(2014)、Rock(2017)指出使用灭活的ASFV作为疫苗株是不切实际的；这可能归因于非中和性ASFV特异性抗体(卡登纳斯-费尔南德斯等，2021)。Gomez-Puertas等报道，磷脂酰肌醇是中和抗体正确表位呈递必需的(戈麦斯-普尔塔斯等，1997)。病毒膜脂质组成在抗体蛋白识别中起着重要作用，但遗憾的是，它未能检测到有效的特异性抗体。灭活疫苗的多次灭活不能在宿主的先天免疫系统中诱导有效的细胞免疫反应，随着对ASFV的日益了解，通过添加可靠的佐剂(Sang等，2020)。该研究团队分别使用“Polygen”和“Emulsigen D”作为佐剂，测试了ASF灭活疫苗的免疫效力，并以21 d的间隔两次接种了6头断奶仔猪。在初次接种后42 d，用同源的、毒力极强的ASFV亚美尼亚2008毒株攻击免疫猪，两者都产生了无中和活性的ASFV抗体，并且很快出现了急性临床症状(Blome等，2014)。尽管灭活疫苗具有抗原性，但它们不能引发完全的细胞免疫反应，从而导致出现不完全的保护作用(Tlaxca等，2015)。经伽马射线照射的ASFV“爱沙尼亚2014”分离株在分别添加Polygen或Montanide ISA 201 VG佐剂后无效。Pikalo等证明，ASFV的高毒力“亚美尼亚2008”毒株不具有保护性，方法是将接种过的疫苗分别接种给断奶仔猪，并在42 d后让它们接触ASFV高毒力的“亚美尼亚2008”毒株，结果发现接种疫苗的动物含有特异性IgG，但没有产生保护作用(Pikalo等，2022)。值得注意的是，接种ASFV-989毒株的猪在接受ASFV的亲代毒株Georgia 2007/1分离2周后表现出完全的临床保护作用。ASFV-989毒株可以作为对抗同源毒株挑战的有希望的减毒疫苗候选株(Bourry等，2022)。上述试验获得了类似的结论，这可能证明目前可用的数据表明，使用现有方法开发有效的ASFV灭活疫苗存在挑战。

5.2 减毒活疫苗减毒活疫苗(live attenuated vaccine，LAVs)

5.2.1 基于天然减毒病毒分离株的LAVs

ASF减毒活疫苗是使用自然或人工方法在体外开发的。该疫苗含有处理过的高活性和强免疫原性的病毒，这可能会增加毒力。

一些天然减弱的ASFV分离株可用于开发ASF弱毒疫苗(Chen等，2020)。已从软蜱和慢性感染的猪上分离出自然减毒的ASFV毒株，如ASFV OURT88/3分离株、ASFV NH/P68分离株和ASFV Lv17/WB/Rie1分离株(Boinas等，2004；Gil等，2008；Arias等，2017)。用ASFVOURT88/3分离株制备的减毒活疫苗对ASFV的同源毒株具有保护作用，但由于猪的个体、接种剂量和攻击毒株存在差异，保护率并不令人满意(Chen等，2020)。在20世纪中期，由联邦病毒学和微生物学研究中心开发的针对ASFV血清型I-V分离株的减毒疫苗，在接种后的第14天对同源血清型的分离株提供了至少4个月的保护(Sereda等，2020)。接种了天然减毒疫苗的猪表现出严重的毒副作用，如发烧、流产和慢性或持续性感染(Gallardo等，2019)。幸运的是，Gallardo等成功地从拉托维亚的一头野猪上分离出一种非HAD-ASFV(基因Ⅱ型)分离株Lv17/WB/Rie1，感染这种毒株后存活下来的实验猪出现了非特异性或亚临床症状(Gallardo等，2019)。这项研究报告了ASFV的非HAD交叉保护性再感染模式，表明ASFV能够在野猪群中长期存在。用天然减毒株免疫的动物表现出明显的副作用，如发热、皮肤损伤和关节肿胀，这阻碍了ASFV天然减毒株疫苗的开发(Leitão等，2001；Mulumba-Mfumu等，2016)。

然而，不同减毒株的免疫保护效果不同，这与攻毒毒株的基因型以及接种剂量和途径有关。ASFV天然减毒株NH/P68(基因Ⅰ型)保护100％的强毒株L60(基因Ⅰ型)免受Arm/07(基因Ⅱ型；Gallardo等，2018)的异源攻击。此外，初次接种ASFV OURT88/3分离株，随后用ASFV OURT88/1分离株进行加强免疫，可产生85％的免疫保护。暴露于ASFVBenin97/1和Uganda1965分离株，分别可获得7％和100％的免疫保护。针对ASFV天然减毒株的免疫接种，可以克服非同源ASFV分离株的挑战(King等，2011)。随后，Gallardo等采用肌内注射或直接接触的方法，用来自波兰(Pol16/DP/OUT21分离株)和爱沙尼亚(Est16/WB/Viru 8分离株)的两种吸血ASFV(HAD毒株)和来自拉托维亚的三种基因型非HAD ASFV(Lv17/WB/rie1分离株；Gallardo等，2021)、波兰的ASFV病毒，迅速引发了致命的急性疾病，而来自爱沙尼亚的ASFV分离株引起了急性或亚急性感染，三分之二的感染猪存活下来。相比之下，感染ASFVLv17/WB/Rie1分离株的猪出现了更隐蔽、症状轻微甚至是亚临床疾病。这项研究提供了关于不同分离株在家猪中传播和排泄的定量数据，并增加了对监管活动的关注。一项实验还表明，诸如给药途径(包括肌内和鼻内途径)以及低剂量和中等剂量的剂量(10³和10⁴TCID₅₀)等因素，都会影响用天然减毒分离株OURT88/3的免疫效果(Sánchez-Cordón等，2017)。

目前，决定使用ASFVLv17/WB/Rie1自然减毒株作为疫苗原型是否是控制ASFV在野猪种群传播的理想策略需要进一步研究(Barasona等，2021)。然而，鉴于用天然减毒株开发的疫苗表现出许多副作用以及病毒再传播的风险，这限制了它们在临床环境中的使用(Chen等，2020)。此外，天然LAVs的免疫保护作用仍有待阐明。

减毒活疫苗的研究最近在全世界范围内取得了显著进展(Liu等，2021)。人工减毒疫苗是通过剔除特定的毒力基因(O'Donnell等，2016；Zhang等，2021)。与其他类型的ASF疫苗相比，LAVs对同源和部分异源分离株可提供完全的保护(Teklue等，2020a)，因此是剖析交叉保护机制的理想工具(Lacasta等，2015；Lopez等，2020)，但毒力、免疫原性以及更重要的病毒表型和抗原多样性问题，继续影响ASF弱毒活疫苗的使用(Revilla等，2018)。

5.2.2 基于细胞传代的LAVs

细胞传代减毒疫苗是一种LAV，在ASFV适应培养的细胞系后，会导致病毒的部分基因组自发缺失，从而降低病毒的毒力。20世纪60年代，一份实验室研究报告称，由于猪骨髓(porcine bone marrow，PBM)细胞的传播而减弱的ASF弱毒疫苗可以抵御强毒株的攻击。然而，Krug等(2015)报道，强毒株(ASFV-G分离株)在Vero细胞中连续传代110次后完全减毒，并且用减毒株免疫的猪没有获得保护。此外，ASFV传代培养物可适应如293和Vero等细胞系，但适应株的毒力和抗原性降低，并且适应株在猪免疫后不提供有效的保护作用(Krug等，2015；Wang等，2021)。

体外ASFV·LAVs通常基于原代细胞，主要由猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)和PBM细胞，但原代细胞不利于LAVs的大规模生产。鉴于LAVs的失败，针对LAVs的研究还需要借用额外的工具。2021年，Borca等(2021a,b)报告说，ASFV-G-δI177L/δLVR分离株保持了与ASFV-G-δI177L分离株相同的减毒水平、免疫原性和保护效力，可在稳定的猪细胞系中有效复制，从而克服了原代猪巨噬细胞的生产限制。令人满意的发现表明，ASFV·MGF-110-9L基因在原代猪巨噬细胞培养中的体外复制能力显著降低，这意味着ASFV MGF-110-9L毒株有能力进一步开发ASF控制策略(Li等，2021a)，涉及cGAS-STING通路和ASFV MGF-505-7R之间的关系有助于揭示ASFV的分子机制(Li等，2021b)。

一些ASFV基因的作用机制已经被揭示，如ASFV的MGF360-9L基因参与干扰素表达的下调，以及I267L基因会抑制RNA Pol-III-RIG-I介导的先天抗病毒反应，导致接种疫苗的猪发生严重和致命的疾病(Zhang等，2021a；Ran等，2022；Zhang K等，2022)。Ramirez-Medina等评估了ASFVMGF110-5L-6L基因在细胞培养和2022年猪实验感染期间病毒复制过程中的作用，并表明MGF110-5L-6L基因的缺失不会影响病毒的毒力或复制(Ramirez-Medina等，2022年a)。在2021年和2022年，分别首次发现了具有抑制宿主先天免疫反应功能的ASFV的非特征蛋白F317L和具有抑制I型干扰素信号功能的其他非特征蛋白EP364R和C129R，为了解ASFV如何抑制宿主产生先天免疫反应和开发ASFV减毒活疫苗提供了新的见解(Yang等，2021；Dodantenna等，2022)。Borca等声称，CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高精度地编辑基因组中的目标序列，从而提高重组ASFV的纯化效率，并为开发重组ASFVLAVs提供了方法(Borca等，2018)。虽然ASF LAVs的研究取得了一些进展，但未来许多问题需要研究和解决。

5.2.3 基于剔除特定基因的LAVs

5.2.3.1 单基因缺失LAVs

设计ASF疫苗的方法目前集中在通过从不同分离株中有针对性地剔除靶向基因来开发改良活疫苗(Turlewicz-Podbielska等，2021)。

5.2.3.1.1  ASFV的Benin 97/1/DP148R基因

Reis等发现，ASFV的ΔP148R基因在猪感染后的早期被转录，并且剔除该基因不会影响病毒在巨噬细胞中的复制，这表明该基因是非必需基因(Reis等，2017)。基于这些发现，通过剔除ASFV强毒株Benin 97/1的基因获得了强毒株Benin P148R。所有感染了该改良毒株的猪都存活了下来。猪感染ASFV Benin P148R毒株只会出现轻微的临床症状，并能够强力抵抗ASFV同源强毒株的攻击。因此，ASFV Benin P148R可以为开发合理的疫苗提供一个靶点。

5.2.3.1.2 ASFV NH/P68/A238L基因、A224L基因、A276R基因、EP153R基因

ASFV的A238L基因参与NFκB和NFAT调节，A224L基因参与凋亡抑制，A276R基因参与I型干扰素调节，EP153R基因是MHC-I抗原呈递的调节因子。Gallardo等通过分别删除这些基因构建了重组NH/P68减毒株，以期开发LAV(Gallardo等，2018)。攻毒的结果表明，候选疫苗对ASFV L60毒株的同源攻击完全有效，但对ASFV基因Ⅱ型Arm07毒株的攻击无效，不过用ASFV NH/P68DA224L免疫的一头猪存活了下来。

5.2.3.1.3 SY18/L7L-L11L基因

Zhang等构建了ASFV L7L-L11L基因缺失株SY18 L7-11毒株，以研究该基因抗ASFV的生物学，并评估其作为候选疫苗的潜力(Zhang J等，2021)。15头猪中的11头在用10头猪免疫28 d后存活10³TCID₅₀和10⁶TCID₅₀。生物学特征表明，ASFV缺失L7L-L11L基因不会影响其在体外的复制。总体而言，ASFV SY18 L7-11毒株可以作为一种安全的疫苗毒株进行更深入的研究。

5.2.3.1.4 ASFV-G/I177L基因

ASFV-G-I177L基因是一个理想的候选者，Borca等(2021a,b)的研究也证明了这一点。对此，Tran等(2022b)评估了ASFV-G-I177L疫苗对6～8周龄猪的安全性，结果证明该疫苗不会引起一般的ASF症状，仅表现出零星、短暂的临床症状，如轻微咳嗽和软便。最重要的是，减毒试验通过连续返回5组猪证明了减毒疫苗的稳定性。因此，ASFV-G-δI177L基因是一种安全可行的候选疫苗。迄今为止，在越南开发的减毒活疫苗(ASFV-G-I177L)是世界上第一种商业化的非洲猪瘟疫苗(Tran等，2022a)。

5.2.3.1.5 ASFV马拉维Lil-20/1毒株，格鲁吉亚2007，Pretoriuskop/96/4(pret 4)/9GL基因

早在2000年，Lewis等向约克夏猪注射了10²、10⁴和10⁶TCID₅₀的ASFV-9GL-R逆转录毒株或突变体ASFV-∆9GL毒株，当用亲代强毒株ASFV Malawi Lil-20/1分离株攻击时，所有感染ASFV-9GL毒株的猪都受到保护(Lewis等，2000)。因此，ASFV-9GL毒株可能被证明是有效的ASF减毒活疫苗株。O'Donnell等在高加索和东欧分离到了ASFV Georgia 2007毒株。构建了缺乏9GL基因的ASFV，然后将其命名为ASFV-G-∆9GL。商品猪肌内低剂量(10²～10³TCID₅₀)的ASFV-G-9GL或ASFV-G，免疫猪能够抵抗毒株的挑战(O'Donnell等，2015b)。此外，从ASFV Pretoriuskop/96/4(pret 4)分离株上剔除9GL基因后也产生了类似的减毒结果(Carlson等，2016)。

5.2.3.1.6  ASFV格鲁吉亚2010/E184L

Ramirez-Medina等通过给猪注射10²HAD₅₀的ASFV-G-δ184 l或ASFV-G毒株，并将它们与感染了来自父母代的ASFV-G强毒株的猪进行比较(Ramirez-Medina等，2022b)。结果表明，基因缺失减毒株ASFV E184L可以区分感染和接种的动物物种(DICA)，但缺失减毒株并不能提供完全的保护。重要的是，E184L是第一个具有DIVA抗原标记功能的实验性ASFV基因产物。

5.2.3.1.7 ASFV BA71/CD2v基因

Monteagudo等报道，通过接种实验猪，敲除ASFV的CD2v基因可显著降低ASFV BA71毒株的毒力。它不仅对亲代毒株BA71有保护作用，而且对异源毒株E75也有保护作用，而诱导的免疫保护作用是剂量依赖性的，并且在不同个体之间有很大的差异(Monteagudo等，2017)。Bosch-Camós等描述了用ba71ΔCD2基因缺失突变病毒对猪鼻内接种，该疫苗诱导了体外召回响应(Bosch-Camós等，2022)。

5.2.3.1.8 ASFV乔治亚/传统知识基因

TK基因与ASFV毒力有关。基于此，Sanford等通过从ASFV格鲁吉亚分离株上剔除TK基因，构建并表征了ASFV-g/VΔTK毒株(Sanford等，2016)。在体外实验表明，该毒株能够在Vero细胞中复制，但复制能力低于亲代毒株。此外，在活体动物体内研究表明，给猪注射10⁶TCID₅₀ASF VG/V-δTK毒株，不会引发疾病，但不能抵抗亲代毒株的攻击。

5.2.3.1.9 我们的T88/3I329L

另一项有前景的研究报告称，通过剔除I329L基因——一种抑制猪体内宿主先天免疫反应安全性的基因，增加OURT88/3的安全性增加，并表明I329L基因的剔除显著降低了对强毒OURT88/1分离株的保护作用(Reis等，2020)。

事实上，并不是所有的ASFV减毒株都可以成为理想的候选疫苗。一项研究发现，分别用自然减毒的ASFV OURT88/3分离株和ASFV的基因缺失突变体Benin δMGF毒株对家猪单次肌内攻毒，结果接种Benin δMGF毒株的猪存活时间更长。接种130 d后，所有猪都出现典型的ASFV症状和高水平的IL-10。高水平的IL-10抑制了机体对ASFV的免疫反应(Sánchez-Cordón等，2020)。如上所述，证据表明免疫系统的调节成分抑制有效保护(Franzoni等，2023)。

此外，LAVs诱导的保护作用与LAVs的复制水平和表达的免疫原性基因的数量有关。如果LAVs的复制严重受损，LAVs诱导的免疫原性也会降低(Gladue等，2021；张等，2021bTran等，2022a)。因此，需要平衡LAVs的安全性和有效性。

未完，待续